PCR热循环仪半定量RT-PCR的方法步骤

                      
   以前用的PCR仪是从离心官底部加热的，不加入石蜡油的话，本来微量的溶液就会因为水的挥发而导致体系浓度增高，难以扩增成功。

  现在的PCR仪改良了，都是从离心管盖上边加热的，解决了那个麻烦。你可以打开仪器看看的。

  过去不用热循环仪是需要在所有反应试剂比如：dNTP，MgCl2，Prime等加完后，后在表面加入一层油的，而现在热循环仪中不再需要加入，请教长期从事PCR的前辈。

   半定量RT-PCR的方法步骤
  1.原位PCR步骤
  1）预处理：
  a.切片常规脱蜡；
  b.2mol/L HCl处理10min；
  c.5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min；
  d.Nase消化组织37℃ 30min；
  e.梯度酒精脱水，室温干燥。

  2.原位扩增：
  a.切片滴加特异性序列引物30μLPCR扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边；
  b.PCR热循环：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，共25～30个循环，72℃延伸10min；
  c.氯仿洗去盖玻片，4％多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脱水，干燥。