影响PCR反应的因素

发布时间2013-09-10        浏览次数：892

理想的PCR反应具有特异性和性，但其受多种因素的影响。
    (一)模板
PCR反应的模板可以是DNA,也可以是多NA，后者的扩增需步反转录成cDNA后才能
作为模板进行PCR循环.模板的质和量会影响PCR反应的特异性和性。
    不同来源的核酸标本，如临床标本（血液、痰液、尿液、体腔积液）、法医学标本（血斑、毛发）病理标本(如组织切片)以及考古标本等.可以选用不同的方法直接提取DNA。无论标本来源如何，待扩增的核酸均需要纯化扩尽使核酸标本中不含蛋白酶、核酸酶，特别是TaqDNA聚合酶抑制剂。
    (二)引物
    引物的选择是整个PCR扩增反应成功的关键。理想的引衡应该有效地与靶序列杂交。引物的质和量直接影杯PCR反应的特异性和性，特别是特异性。
1.PCR反应对引物的要求
   合成的引物必须经聚丙烯酞胺凝胶电泳或反向高压液相色谱(HP1.C)纯化，以减少发生非特异扩增的可能性。冻干引物可以在常溢下运输.冻干引物于一20℃可以保存12-24个月，甚至长，液体状态于-20℃可以保存6个月或长
2.引物对PCR反应的影响
    两条引物的用量一般为每条0.1~0.5mmol/L浓度太高会引起错配及非特异性扩增,增加引物之间形成二聚体的概率;引物浓度太低则可能达不到扩增效果或PCR产太低。
    (三)循环温度和时间
    PCR扩增反应的三个基本步骤即变性、退火和延伸在反应体系的合适条件下进行。变性温度一般为90-96 .C，在此温度下既能使DNA双链模板变性，又能保持Taq DNA聚合酶活力。退火温度必须严格按照形成模板一引物杂交体的实际需要选择，可根据公式几=4(G+C)+2(A+T)计算。退火温度太高，会因为不能形成模板一引物杂交体而不能有效扩增目标片段，退火温度太低易出现非特异性扩增。退火温度选择的一般原则是应低于几值5℃。多数PCR扩增反应的退火温度在50-65℃。延伸温度常用70-74℃。延伸时间长短根据待扩增的目标DNA片段长度确定。循环次数的确定，以既能达到扩增目的又尽量减少非特异性产物的扩增为原则。PCR仪的循环次数一般为2035次.循环次数过多将增加非特异产物。
    (四)Taq DNA聚合酶浓度
   Taq DNA聚合酶在反应体系中的终浓度常为2~2.5u/100uL。酶量过少，合成pcr产物量低，酶址过高则非特异性产物随之增加。
    (五)镁离子浓度
  镁离子浓度对PCR产物的特异性.和产址有明显影响，特别是对Taq DNA聚合酶催化的
PCR反应的影响尤为明显。过址的镁离子会导致非特异产物的扩增，而镁离子浓度过低，又会使Taq DNA聚合酶的催化活性降低.，一般镁离子浓度为0.5-2.5 mmol/L。
    (六)脱氧核昔三磷酸浓度
4种 dNTP（dATP、dCTP、dGTP\dTTP）在反应中浓度应相等，一般为200umo1/L。浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶活性，且引起Taq DNA聚合酶催化的碱荃错配。