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PCR污染源中的处理方法
发布时间2013-08-13 浏览次数：625
一、环境污染源处理：
(1)稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤。
(2)紫外照射法： 254/300nm波长紫外线照射30分钟。适用于500bp以上长片段核酸。
二、反应液污染源处理：
(1)DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I,室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列。
(2)内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如Msp I和Taq I等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR。
(3)紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，适用于500bp以上长片段核酸。
三、尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
(1)原理：在PCR产物或引物中用dU 代替dT.这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
(2)dUTP法：用dUTP代替dTTP,使产物中掺入大量dU.在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。
(3)dU引物法：合成引物时以dU 代dT,这样PCR产物中仅5ˊ端带dU.UNG处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP低，而用dU法就可克服这一缺点。dU引物将dU设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。
(4)优点：可以去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU存在，可彻底消除污染源。
(5)需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR产物克隆时，应该转化UNG-（UNG缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG消化掉。
四、固相捕获法
用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：
(1）用一生物素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区。
(2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质
(3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交区域。第(2)步的漂洗后可用PCR检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。
五、RS-PCR法（RNA-specific PCR）
也称为链特异性PCR,主要指用于RNA模板的特异性PCR法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端(A区)有2 0个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0个核苷酸(C区)为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使 cDNA与多余引物分开，再用和第二引物(C)以链cDNA为模板合成第二链cDNA,以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C进行扩增加尾cDNA,而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。
六、抗污染引物法
该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。