公司新闻
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关于荧光定量PCR,你想要了解的都在这里了!

发布时间2019-11-01        浏览次数:187

荧光定量PCR,是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。

 

一、原理

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。或者使用荧光染料SYBRSYBR可以结合到双链DNA上面,当体系中的模板被扩增时,SYBR可以有效结合到新合成的双链上面,随着PCR的进行,结合的SYBR染料越来越多,被仪器检测到的荧光信号越来越强,从而达到定量的目的。

 

二、应用领域

临床疾病诊断:各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价;地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测;肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断;遗传基因检测实现遗传病诊断。

动物疾病检测:禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。

食品安全:食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。

科学研究:医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。

应用行业:各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

 

三、荧光定量PCR前景展望

实时荧光定量PCR的出现,极大地简化了定量检测的过程,而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现,使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率,反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。随着生物芯片技术和荧光探针定量技术的结合,荧光定量PCR在医学检测及其他各个领域中的应用前景将更加广阔,令人欣喜。尽管如此我们也应清晰认识到,FQ-PCR技术在我国各个研究领域的应用并不多见,这就需要我国学者迎头赶上,使FQ-PCR技术更充分地推广,以推动研究工作的快速发展。

 

四、荧光定量PCR实验操作步骤

(一、)荧光定量PCR样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离 每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,1530℃孵育23分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%

RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后1530℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。

RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

(二)荧光定量PCRRNA质量检测

1)紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。

① 浓度测定

A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下:

RNA溶于40 μl DEPC水中,取5ul1:100稀释至495μlTE中,测得A260 = 0.21

RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 0.84 μg/μl

5ul用来测量以后,剩余样品RNA35 μl,剩余RNA总量为:

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

②纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.82.1

2)变性琼脂糖凝胶电泳测定

①制胶

1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml10× MOPS电泳缓冲液和18 ml37% 甲醛溶液(12.3 M)

10×MOPS电泳缓冲液

浓度 成分

0.4M MOPSpH 7.0

0.1M 乙酸钠

0.01M EDTA

灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

②准备RNA样品

3μgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

③电泳

上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。56V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少23cm

④紫外透射光下观察并拍照

28S18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNAtRNA5S核糖体RNA)组成。在18S28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

(三、)荧光定量PCR样品cDNA合成

①混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5μl37℃水浴60分钟。

③取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃待用。

(四)荧光定量PCR样品

管家基因(β-actin)实时定量PCR

①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011,反应前取3μl10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010,依次稀释至109108107106105104,以备用。

②制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:932分钟,然后931分钟,552分钟,共40个循环。

(五)荧光定量PCR模板

①针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

PCR产物与 DNA Ladder2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010,依次稀释至109108107106105104几个浓度梯度。

(六)荧光定量PCRPCR

①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。

②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:932分钟预变性,然后按931分钟,551分钟,721分钟,共40个循环,最后727分钟延伸。

   (七)荧光定量PCR引物列表

引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(

(八)荧光定量PCR电泳

各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

 



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